体细胞核移植（SCNT）技术已被广泛应用于多种哺乳动物的克隆，包括羊、牛、鼠、猪、山羊、兔和狗。科幻电影里的克隆生物正在逐渐成为现实，这些克隆动物在推动生物医药行业发展、捍卫人类生命健康的进程中立下了汗马功劳。

然而，对于克隆非人类灵长类动物（NHPs）的病理研究仍是十分有限的。尽管体细胞核移植技术已经成功克隆食蟹猴，但由于对重编程机制的了解有限，其生存效率仍然很低。

2024 年 1 月 16 日，中国科学院中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（中科院神经所）孙强、刘真团队与中国科学院遗传与发育生物学研究所陆发隆团队再次于克隆猴领域取得重磅进展，在 Nature Communications 杂志发表研究论文 Reprogramming mechanism dissection and trophoblast replacement application in monkey somatic cell nuclear transfer。

该研究首次建立了一种专门针对恒河猴的滋养层替换方法，将来自体细胞核移植（SCNT）胚胎的内细胞团（ICM），注射到来自卵胞浆内单精子注射（ICSI）胚胎的囊胚腔中（去除 ICM），成功地克隆出一只健康的雄性恒河猴——在为克隆胚胎提供健康的胎盘后，这只恒河猴存活了两年多。

图片来源：Nature Communications

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研究背景

1996 年，克隆羊「多莉」诞生，此后 20 多年间许多哺乳类动物陆续克隆成功，然而灵长类动物的克隆研究长期阻滞不前，甚至有人认为「灵长类动物不可能克隆成功」。

2017 年底，中科院神经所孙强团队（刘真为第一作者）经过 5 年努力，终于在该领域实现了「0 的突破」，创造出世界首例体细胞克隆猴。

他们使用猴胎儿成纤维细胞，通过体细胞核移植技术首次创造出克隆食蟹猴，将获得的 79 个克隆胚胎（处于 2 细胞至囊胚期）移植入 21 只代孕母猴中，最终有 6 例妊娠，并获得 2 例健康的后代，命名为「中中」和「华华」。

该研究于 2018 年 1 月 25 日正式发表在顶尖期刊 Cell 杂志。

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该研究证明了克隆猴的可行性，为利用 SCNT 成功克隆长期存活的恒河猴奠定了坚实的基础。

本团队曾尝试使用与克隆食蟹猴相同的方案来克隆恒河猴，但收效甚微。因此，该团队另辟蹊径通过采用一种滋养层细胞替代（Trophoblast Replacement，TR）的策略，也称为 SCNT-TR，结合表观遗传调节剂 Kdm4d 和 TSA 的治疗，提高恒河猴的克隆效率，首次建立了一种恒河猴内细胞团（ICM）的特异性细胞移植方法。

研究内容和结果

首先，本研究发现克隆的非人类灵长类动物胚胎的重编程缺陷，能够在着床期或围着床期表现出来。研究团队将 484 个克隆恒河猴胚胎移植到 96 个代孕体中，平均每个代孕体移植 5 个胚胎。然而，克隆恒河猴胚胎的着床率不到 ICSI 恒河猴胚胎的一半。此外，与正常受精产生的胎儿活产率相比，大多数 SCNT 胎儿在植入后阶段死亡。

因此，该团队研究对卵胞浆内单精子注射（ICSI）和体细胞核移植（SCNT）克隆猴囊胚的表观遗传学数据集进行了比较分析，发现发育中的克隆胚胎及其胎盘获取和读取遗传信息的方式存在异常，SCNT 猴囊胚中 DNA 甲基化的普遍减少和母体印迹基因的缺失，在代孕体中发育的克隆猴胎盘的大小和形状也存在异常，胎盘组织显示有明显的增生和钙化。

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为了解决这些问题，本团队开发了一种为发育中的克隆胚胎提供健康胎盘的方法，即用卵胞浆内单精子注射 (ICSI) 胚胎的滋养层（ICM）替换体细胞核移植（SCNT）滋养层（滋养层是发育中胚胎的细胞外层，能够形成胎盘的主要部分）。将 SCNT-ICM 注射到 ICSI 囊胚中，在引入 SCNT-ICM 后，立即通过显微操作将 ICSI 囊胚中的原始 ICM（ICSI-ICM）移除，从而为发育中的克隆胚胎提供健康胎盘。

之后，比较了克隆猴的线粒体 DNA（mtDNA）和卵细胞供体猴的线粒体 DNA 中的 SNPs。值得注意的是，所有位点都表明克隆猴的核基因组与作为供体的成纤维细胞系的核基因组相同。其中，SCNT-TR 恒河猴的外胚层和中胚层只检测到一个 X 染色体拷贝，这意味着雌性胎盘支持雄性 SCNT 胎儿的足月发育。

利用上述方法，研究团队共构建了 113 个克隆恒河猴胚胎，并将其中 11 个植入到 7 只代孕恒河猴体内，最终 2 只恒河猴怀孕，其中一只恒河猴怀孕 157 天后，生下了一只健康的雄性恒河猴，研究团队将其取名为 ReTro，目前已经存活了两年多。另一只怀孕恒河猴怀有双胞胎，但在妊娠第 106 天妊娠终止，没有采集到胎儿组织。

图片来源：Nature Communications

研究总结

由于 SCNT-TR 恒河猴胎盘的钙化程度与 ICSI 恒河猴胎盘相似，研究团队认为防止胎盘过早钙化可促进克隆胎儿植入后的发育。滋养层细胞替代可以恢复胎盘中 DNA 甲基化的异常丢失，并防止恒河猴 SCNT 胎盘出现高度钙化表型。

近一半的克隆猴胎儿在妊娠期 60 天之前丢失，这表明 SCNT 胚胎在植入过程中存在缺陷。本研究团队通过整合植入前和植入后猴胚胎的 WGBS 和 RNA-seq 数据集，详细地剖析了体细胞重编程机制，为非人类灵长类动物克隆引入了一种具有前景的策略。

更重要的是，滋养层细胞替代技术还可能对辅助生殖技术领域产生更广泛的影响。这一进展为进一步研究和探索滋养层细胞治疗方法的优化打开了大门，有可能将其应用扩展到其他类型的不孕症，如反复植入失败和某些影响滋养层的遗传疾病。

题图来源：Nature Communications

参考资料：

1. Liao, Z., Zhang, J., Sun, S. et al. Reprogramming mechanism dissection and trophoblast replacement application in monkey somatic cell nuclear transfer. Nat Commun 15, 5 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43985-7

2. Liu Z, Cai Y, Wang Y, et al. Cloning of Macaque Monkeys by Somatic Cell Nuclear Transfer [published correction appears in Cell. 2018 Jun 28;174(1):245]. Cell. 2018;172(4):881-887.e7. doi:10.1016/j.cell.2018.01.020